低频声波频率下瘤背石磺CaM-like、CaMKII基因的表达及功能

长期栖息于潮间带的动物能够感知当地的潮汐规律,形成潮汐记忆的能力。本研究以栖息于潮间带的瘤背石磺(Onchidium reevesii)为对象,研究其通过感知潮汐来临时产生的低频声音来调节其行为与潮汐节律相协调的分子机制。通过RACE-PCR技术克隆到CaM-like基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和qRT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺CaM-like基因的cDNA全长2321 bp,包括5′非编码区(UTR)366 bp,3′非编码区(UTR)1337 bp,618 bp的开放阅读框编码206个氨基酸;预测该基因编码的多肽链的原子数量是3165,分子量约为23029.64 kD,理论等电点4.64,分子式是C_(1018)H_(1544)N_(274)O_(320)S_9。N端信号肽由29个氨基酸组成。氨基酸序列比对构建系统进化树,结果显示瘤背石磺CaM-like基因与静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)、光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)的CaM-like基因的亲缘关系最接近,这与传统形态学分类相吻合。在实验室内模拟潮汐中低频声音刺激瘤背石磺,应用qRT-PCR检测CaM-like基因在不同组织的分布情况,结果显示CaM-like mRNA在瘤背石磺不同组织均有表达,但神经节部位的表达量显著高于背部皮肤、腹足、肠、肝胰腺、口器和蛋白腺等组织(P0.05),推测其可能参与神经系统的可塑性调节。荧光定量结果显示CaM-like、CaMKII基因分别在25 Hz和50 Hz低频声波下刺激12.4 h表达量较高,初步推测其能感知25～50 Hz声波频率。这可能与栖息于潮间带中的瘤背石磺长期感知12.4 h半日潮潮汐周期节律,形成潮汐记忆有关。本研究将为进一步深入了解瘤背石磺感知潮汐节律的分子机制奠定基础,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供依据。     

瘤背石磺人工繁育关键技术的研究

研究了瘤背石磺亲体在不同温度、盐度下受精卵的孵化及不同开口饵料、不同附着基对浮游幼虫的培育和附着效果。结果表明,不同饵料对亲体的成活率无显著影响,各组成活率均超过95%;在(27±1)℃、不换水条件下,5、10、15、20、25、30的各盐度组中,以15、20盐度组的孵化率最高,分别为96.4%、95.8%;在盐度15、不换水条件下,(24±1)(、27±1)、(30±1)、(33±1)℃温度组,受精卵产出后至孵化出膜的时间分别需319、297、2862、78 h;采用自制孵化框漂浮式孵化,孵化率高达98%;不同开口饵料试验结果表明,金藻投喂组幼体成活率最高,为87.5%;不同附着基附着培养试验10 d后,悬浮球填料组的成活率最高,达90%,且个体整齐、生长速度快,而铺泥组为43%,不加附着基组仅38%。     

瘤背石磺的生态习性观察

2003年4～7月，作者对江苏射阳河口滩涂的瘤背石磺作了生态调查，并在室内进行温箱试养，观察其运动、呼吸、消化、生殖及对刺激物的反应等。结果表明，瘤背石磺栖息在潮上带滩涂，其每千克土壤中含N 0．325g、P 0．020g、K 0．521g、Cl 0．084g、有机质7．68g，土壤pH值9．43，含盐量1．615；在温度20～28℃，湿度接近100％时瘤背石磺才出来活动和摄食；在人工饲养下，瘤背石磺喜食螺旋藻。从解剖上看，它用呼吸腔呼吸，外套膜切片中有钙质颗粒，说明该物种是腹足纲动物由水生向陆生过渡的类型，体现了肺螺亚纲的特征。     

水温对石磺胚胎发育的影响

通过实验室研究，对石磺（Onchidium sp．）胚胎发育过程进行了详细观察，比较了不同水温下石磺胚胎发育的速度，探讨了膜内面盘幼虫孵化出膜的主要条件。结果表明：石磺的胚胎发育过程类似于肺螺亚纲其他贝类，行体内受精，刚产出的卵为受精卵，细胞未进行分裂，卵裂从卵产出体外开始，分别经过卵裂期，囊胚期，原肠期，膜内担轮幼虫期，膜内面盘幼虫期，经过孵化期孵化出膜为自由生活的面盘幼虫期。对各阶段幼体的大小、形状、内部器官等特征以及发育变态过程进行了详细的显微观察和描述。26℃，28℃，30℃3个水温组中，从受精卵到膜内面盘幼虫孵化出膜分别需要300h，290h，288h；发现影响幼虫孵化出膜的主要因素是水温和海水的刺激作用；繁殖盛期卵群工厂化水泥池自然水温孵化时间为10～14d。并报道了水温低于23℃时石磺胚胎停止发育现象。     

成体瘤背石磺不同组织中的重金属含量及其评价

采用原子吸收法测定了瘤背石磺栖息地(崇明北支芦苇滩涂)的水质、土壤及成体瘤背石磺不同组织中的各项重金属含量,并与相应的国家标准进行了比较。结果表明:瘤背石磺栖息地的水质和土壤基本符合相应的国家标准,仅土壤中的Cu和Zn含量略超过国家标准《土壤环境质量标准》,污染指数分别为1.39和1.09。瘤背石磺肝胰腺中积累了较多的Cu、Zn和Fe,含量分别高达314.33、258.33和192.40μg/g组织湿重,两性腺中的Zn含量为309.33μg/g组织湿重,显著高于其它组织(P<0.05),肌肉和卵黄腺中的重金属含量均较低。除Cd含量外,瘤背石磺肌肉中的其它重金属含量均符合国家标准《农产品安全质量:无公害水产品安全要求》中的规定要求,但是肌肉中Cd含量远低于CAC标准(国际食品法典委员会标准)规定的2.0μg/g湿重。     

盐度对石磺胚胎发育的影响

28℃水温下,实验室内比较观察了盐度为0、3、69、、152、0、30、40八组水体中石磺(Onchidiumsp.)受精卵的胚胎发育状况,并对囊胚期的胚胎进行了低盐度(0、3、6、9)培育试验。结果表明:石磺受精卵在不同盐度水体中的胚胎发育状况有很大的差异,盐度0组中的胚胎畸形率高达97%±2%,盐度3组中的胚胎畸形率达75%±2%,盐度30组中停止发育的胚胎(即单卵黄球胚胎)比例为60%±4%,盐度40组中停止发育胚胎的比例达98%±2%,盐度6、91、5、20组的胚胎能正常发育,孵化率均在90%以上;石磺卵群孵化的适宜盐度范围为6~20。囊胚期的胚胎适应低盐度的能力稍强,盐度0组中的囊胚期胚胎分裂球解体,不能正常发育;盐度3、6、9组中的囊胚期胚胎能正常发育。盐度为23.4和27.4的自然海水环境中,石磺胚胎也能正常发育和孵化。     

盐度对石磺胚胎发育的影响

28℃水温下,实验室内比较观察了盐度为0、3、69、、152、0、30、40八组水体中石磺(Onchidiumsp.)受精卵的胚胎发育状况,并对囊胚期的胚胎进行了低盐度(0、3、6、9)培育试验。结果表明:石磺受精卵在不同盐度水体中的胚胎发育状况有很大的差异,盐度0组中的胚胎畸形率高达97%±2%,盐度3组中的胚胎畸形率达75%±2%,盐度30组中停止发育的胚胎(即单卵黄球胚胎)比例为60%±4%,盐度40组中停止发育胚胎的比例达98%±2%,盐度6、91、5、20组的胚胎能正常发育,孵化率均在90%以上;石磺卵群孵化的适宜盐度范围为6~20。囊胚期的胚胎适应低盐度的能力稍强,盐度0组中的囊胚期胚胎分裂球解体,不能正常发育;盐度3、6、9组中的囊胚期胚胎能正常发育。盐度为23.4和27.4的自然海水环境中,石磺胚胎也能正常发育和孵化。     

瘤背石磺多糖对人宫颈癌细胞的体外抑制作用

体外试验研究瘤背石磺多糖（Onchidium reevesii polysaccharides, OSP）和硫酸酯化修饰后瘤背石磺多糖（Sulfated Onchidium reevesii polysaccharides, S-OSP）对Hela人宫颈癌细胞生长的影响,并以阳性药物顺铂(0.5 μg/ml、0.75 μg/ml、1.5 μg/ml)作为对照。将不同浓度（50 μg/ml、75 μg/ml、150 μg/ml）的OSP和S-OSP作用于Hela细胞,用CCK-8法分析Hela细胞在12h、24h、48h和72h的增殖情况,用流式细胞仪分析细胞周期,并应用qRT-PCR检测相关凋亡基因的表达变化。结果表明OSP和S-OSP均能降低Hela细胞活性并诱导其凋亡,而且S-OSP比OSP更能显著抑制Hela细胞增殖活性（P<0.05）,表明硫酸酯化修饰改变了多糖结构进而影响多糖抗肿瘤活性。作用48h后,三种浓度OSP组Hela细胞生长抑制率分别为60%、67%、71%;S-OSP组Hela细胞生长抑制率分别为74%、77%、84%;顺铂组Hela细胞生长抑制率分别为82%、86%、90%。流式细胞术检测显示OSP和S-OSP作用24h后,细胞早期和晚期凋亡的比率显著（P<0.05-0.01）,G0/G1期细胞比例增多,S期细胞比例不断降低;实时荧光定量表明促凋亡基因Caspase-3的表达量随药物浓度的提高显著增加,抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达量随药物浓度的提高无明显变化,说明OSP和S-OSP可通过调节Caspase信号通路诱导Hela细胞凋亡。     

瘤背石磺肌球蛋白重链(MyHC)基因的克隆与表达分析

肌球蛋白是动物体内重要的功能性马达蛋白,调控机体的信号传导、肌肉收缩和细胞器运动,为探究肌肉在瘤背石磺(Onchidium struma)由海洋向陆地进化过程中发挥作用的分子机制,实验以石磺科4种贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MyHC)基因cDNA的全长并进行组织表达分析。研究结果显示,瘤背石磺MyHC基因cDNA全长为7566 bp,包括5895 bp的开放阅读框,228 bp的5'端非翻译区,1443 bp的3'端非翻译区,共编码1964个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质由31713个原子组成,分子式为C_(9765)H_(15897)N_(2849)O_(3150)S_(52),分子量约为225.28 kDa,理论等电点为5.56,N端信号肽具有29个氨基酸长度。瘤背石磺MyHC具有2个保守结构域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l,且亲水性氨基酸集中在Myosin_tail_l区。系统进化树分析显示,瘤背石磺MyHC与光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)MyHC的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MyHC基因在各个组织中均有表达,腹足和背部皮肤表达量最高,腹部皮肤、口球、肺囊中高表达,肝胰腺、蛋白腺、两性腺中微量表达(P0.05)。MyHC基因在瘤背石磺的主要运动器官腹足中高表达,说明肌肉运动对瘤背石磺湿地环境的两栖适应性具有至关重要的作用。实验结果为今后进一步研究瘤背石磺肌球蛋白重链基因进行原核表达及多克隆抗体的制备奠定了良好基础,更为深入探讨海洋无脊椎动物从海洋向陆地进化的研究提供有参考意义的分子依据。     

不同规格瘤背石磺胃盲囊组织学初步研究

通过组织学观察与组织化学染色,研究了野生瘤背石磺不同体重(2～25 g)与胃盲囊的组织结构和PAS阳性细胞及肥大细胞的分布关系,为进一步探讨瘤背石磺消化生理和食性提供理论依据。结果发现:瘤背石磺胃盲囊组织主要由浆膜层、粘膜下层、固有膜和粘膜上皮层构成。瘤背石磺胃盲囊绒毛主要有两种类型,分别为非纺锤型绒毛和纺锤型绒毛,其中非纺锤型绒毛比例有随瘤背石磺体重增高而降低的趋势。胃盲囊横截面积、绒毛长度和粘膜上皮高度均有随瘤背石磺体重增高而增高的趋势,其中尤以低体重组(<8 g)和高体重组(>18 g)差异明显(P<0.05)。经PAS染色和肥大细胞染色后,发现仅在高体重组(>18 g)瘤背石磺胃盲囊绒毛粘膜上皮有大量的PAS染色阳性细胞和肥大细胞分布。